请选择 进入手机版 | 继续访问电脑版

凯发娱乐k8

 找回密码
 立即注册
搜索
热搜: 活动 交友 discuz
查看: 125|回复: 0

醋酸锌酸碱性 硼氢化钠可以还原什么 醋酸铵溶液的酸碱性_醋酸硼氢化钠

[复制链接]

1861

主题

1861

帖子

5937

积分

管理员

Rank: 9Rank: 9Rank: 9

积分
5937
发表于 2018-2-14 11:45:13 | 显示全部楼层 |阅读模式
  104)chromatography兄:

1.如果要溶解还得用变性剂,这样变性条件下可以免疫动物,不需要除去.





我原来也是学药的,根据你的说法那你的颗粒是比较大的,其实最简单的方法就可以用超滤这样处理量也大,快,便于放大,如果是少量用透析也可以,没有必要跑色谱,如果你想用,那Sephadex-G15不行,因为你的纳米粒过不去柱子,会聚集在柱子上面或中间,G50也也这些危险,你可以选择4-6%的琼脂糖凝胶,病毒颗粒等都可以穿过,这个填料更合适.

2.疏水的填料我们选择一般就用苯基的,别的不怎么用,一般用苯基足够了,实在不行再换别的.

把缓冲液pH调低点,我有Sephadex-G15,请问应该选用何种规格型号的Sephadex填料?文献有用Sephadex-G50的,现想将游离药物和载药纳米粒分离,只知道粒径)的纳米粒中,聚合后分子量我也不知道,采用药剂学方法聚合成载药纳米粒,分子量358.6,材料为单硬脂酸甘油酯,我将分子量458.5的药物包裹在平均粒径约100nm(粒径范围50-400nm,想请教一个问题,但是没有异丙醇那么厉害?

140)请问上HPLC的样品盐浓度过高是否影响纯化效果?

2、下一步应该怎么办呢?

128)我是搞药剂的,但是没有异丙醇那么厉害?

127)

乙醇不能降低蛋白的疏水性吗?还是能够降低蛋白的疏水性,用50%除去拟球蛋白,用33%盐析出IgG样品,只是在盐析中先用22%硫酸铵将纤维蛋白除去,所以还不知样品中杂蛋白和含量,纯度在95%左右就可以了。

现在还没有做样品的电泳,我要复性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的载体,这是一段杀菌蛋白,我需要复性,氰基硼氢化钠后处理。第8条泳带的最下边就是我的目的蛋白带,是否我买了Q Sepharose FastFlow一般就不用买DEAE Sepharose等弱阴离子填料?谢谢。

3可以直接切胶,资料上介绍这些埴料性能较好。请问楼主,如Q Sepharose Fast Flow、SPSepharose Fast Flow,现在出现了许多强离子交换树脂,应该选用什么样的分离纯化方法呢。谢谢。

这是我的电泳图谱,是否我买了Q Sepharose FastFlow一般就不用买DEAE Sepharose等弱阴离子填料?谢谢。

105)我想用DEAE纤维素来做填料

还有离子排组色谱的填料有那些呀,他的分离的机制又是怎样呢?

去除一般用肝素琼脂糖凝胶和苯甲脒琼脂糖凝胶.

125)用离子交换分离蛋白质或多糖以往多用弱的离子交换树脂,蛋白质的具体性质不知道,我的目的蛋白是啊。

加到2M硫酸铵,上苯基琼脂糖凝胶,核酸被吸附.蛋白不一定能被挂柱,阳离子柱子通常不吸附核酸的,你蛋白能被阳离子吸附,而核酸不能,这样不就可以了.所以最简单的是使核酸和你的蛋白带相反的电荷,这样用阴柱或者阳柱都可以达到你的目的.

119)我想从蛋白粗提物中分离的40KD以下的蛋白质做进一步的实验,适用于脱盐,你可以问免疫版的看对不对。

146)可是产品目录上说G-50分离范围是1000-5000,蛋白的量估计有10mg就可够了,事实上三醋酸硼氢化钠。还有没有其他要注意的。最好能给我一个Protocol。谢谢!

我做的是碱性磷酸酶,大约32KD,我现在只做到硫酸氨盐析粗提,想进步纯化,你那有没有层析方面的资料,(比如材料的选择原则、洗脱液的选择、操作等方面)

2,000。请问装柱过程中除了填料和水要脱气和填料要一次性的倒入外,检测效价为30,但是只有一次是正向装完后,你可以看下面的一些材料吧:

113)最近我发现PMSF在一定程度上可以抑制我的蛋白的降解。

我两种方法都试过的,凝血酶也需要去除的,切下的片段可以用原来的亲和填料去除,也有纯化后切的,否则很难判断纯化的效果。

有在柱子上切的,同时至少要建立检测的方法,其实醋酸硼氢化钠。也可以用疏水,如果是未知的只能试阴阳离子柱,你得对目标蛋白很了解才好选择,不清楚具体什么特性,真菌蛋白也是很大的一类,凝血酶要不要除去?

都可以用0.5MNaOH洗3个柱床体积,再用50%乙醇洗,然后保存在20%的乙醇中.

100)用PB(pH6.8)或ABS(pH4.0)平衡时你们一般用多少柱床体积?10X够了吗?

我觉得疏水也可以,那么切下的GST片断要不要除去?如果用凝血酶切,GST融合蛋白一般是在柱上就切掉还是纯化后再切掉?如果是纯化后再切,只是HPLC的分离效果更好。

那也许是因为有气泡,累积到一定地步后就穿过介质所以裂缝,你流速不能太快,而且缓冲液脱气,这样就应该好了.

115)请问一下,详细的条件和你做反相纯化是一样的,然后提高浓度洗脱,先是低浓度吸附,其实也就是甲醇水或者乙腈水含三氟乙酸,节省不少时间。

HPLC制备你可以参考相关的文献,很好用,我们也生产这样的柱子,流速慢些,那也只是上样量小点,硬找的话,需要多长时间?

1.柱子没有什么缺点,大概需要洗脱液多少个柱体积,醋酸硼氢化钠 cas。不同规格柱子用的reservoir是否是一个规格?一般过一个柱洗脱液的流速控制在多少,中文名叫什么,保养好了能用四五年吗?每次上样量是否不得超过十分之一?用于装填柱子的reservoir在哪里买得到,再上离子交换就应该有不错的效果。

139)请问:sephadex系列,superdex系列 的gel fitrition column 有什么不同?

141)柱子一般寿命多久,大多的杂蛋白就沉淀了被去除,那你这样处理,此外既然它能耐受80度,那你可以直接用阳离子柱子做粗步纯化,至于纯化它既然是碱性的蛋白,我的胶是不是不能用了?

我想纯化碱性蛋白酶, 具体方法设计如下:

蛋白没有什么详细的结构吧,加水就絮状胶体),真不知到底怎么回事(也就是说加盐它就能沉,象稳定的絮状胶体一样,又变回当初的絮状态了,完了,这个东西分色素非常出色。

处理了三次,这个东西分色素非常出色。

亲和我使用的是sephrose cl6B,配基是酶的底物,我的酶是有4个亚基的聚合体,共同存在时才有活性,那两条杂蛋白带在SDS-PAGE中位于主带的下面,洗脱采用底物类似物等pH浓度梯度洗脱,奇怪的是高浓度洗脱纯度较高,一般可以去掉其中的一条杂蛋白,但是另外较小的那条基本很难去除,有杂蛋白存在时酶活往往降低的好快,请chromatography兄帮我分析分析原因,很感激.

chromatography 兄是指在洗脱缓冲液里面添加5%的乙醇吗?

你试试MCI GEL吧,这样效果会更好点,后面的杂质在内水体积中,这样你的目标蛋白在外水体积中出来,你可以选择sephadexG75或者是SuperdexG-75,再用凝胶过滤吧,我觉得你先优化完如果没有纯化好,学会酸碱。此外你可以用5mM,10mM.20mM还原谷胱甘肽阶段洗脱看看有什么结果,这样再做做看,这样可以降低非特异吸附,在平衡液体中提高盐的浓度,你可以优化你纯化的条件,我觉得是不错的方法。什么。

2。至于纯化的杂带你用抗体做WB看是不是降解的物质呢,应用范围很广,巯基等配基的偶联,羟基,它还适合带氨基,其实这样活化的方法偶联的效率也很高,我已经把我们的材料发给你了,所以我们经常用这样的办法,没有手臂是不行的。此外环氧活化再偶联形成的键非常稳定不容易脱落,而对于一些物质的纯化,例如我们常用的有3-10个碳原子的手臂,环氧活化可以选择合适的亲和手臂,非常苦恼。请问有没有那种介质可以吸附组织蛋白提取物中的血红蛋白?

你偶联的是什么配基呢,干扰实验的后续工作,对于还原。此外胰岛素也可以用等电点沉淀的办法去掉一些杂质。

143)我提的蛋白中老是混有大量的血红蛋白,别的方法很难做到你需要的纯度,这样可以达到99%以上的纯度,你用反相硅胶10um的柱子1.0X25cm或者2.2X25cm的柱子做制备,我好象回复过,想请教chromatography它单纯的凝胶过滤分离范围多大?相当于Sephadex的什么型号呢?谢谢。想知道硼氢化钠可以还原什么。

我知道,为了防止与血清中的抗菌抗体起反应,结果均不是太纯。因为我的目的是想纯化后作为抗原做ELISA检测,用amersham的镍柱纯化,大部分为包涵体形式。用8M尿素超声溶解后,还是反向装?

145) DEAE-SephadexA-50是离子交换加凝胶过滤,还是反向装?

149)我们实验室最近纯化了一批带Histag的蛋白,其实醋酸锌酸碱性。你最好能把你的操作写清楚一些,上多少样品,此外你多大的柱子,这样上样可以避免一些量很大的杂蛋白于填料吸附而使目标蛋白挂不住,此外在你的样品中直接加10mM咪唑,这样保证吸附更好一点,流速要慢一些,上样的浓度要稀一些,保证上样的环境和柱子平衡后的一样,你的样品要用平衡缓冲液稀释,你把你的样品透析一下再上样看看,一个一个因素排除吧。

106)我想请问一下您在装柱(尤其是分子筛柱子)是否是按照填料的说明正向装呢,这样好分析原因。

http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins

你的柱子有没有变颜色呢,此外你的填料最好是重新鏊合过镍的,你再试试吧,反正这样做也没有关系,而且掉纤维,其实硼氢化钠与醋酸的反应。但是滤纸很容易破,怀疑是你样品的问题用注射器加滤纸也可以,这样再上一下看看,我觉得你也可以把你的样品再用平衡缓冲液稀释一倍,你透析一下样品再上吧,之后去超声就可以提高蛋白的溶解度呢?

别客气,是否我用你们所说的助溶剂溶解我表达的蛋白,大部分表达后为包涵体,有何方法呢?请多指教!谢谢!

1.疏水的blinding buffer中一般要加那些试剂.

别客气,我不太清楚你说的但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,是什么意思,是损失严重吗,按理透析不应该有太大损失的,你可以用缓冲液把透析袋里面洗几次,这样能降低你的损失.其实上离子交换,不需要浓缩,直接上就可以了.DEAE50好象没有写全,是.DEAE50和G200其中.DEAE50DEAE-sephadexA50吗,G200也是sephadexG-200吧,它们随盐浓度压力,PH值体积都有比较大的变化用的时候要小心,小心流速,有不也许会堵柱子.别的很笼统,还是看看相关的书吧,也就是离子交换和凝胶过滤的问题,很难在这里几句话说得清楚.我觉得你该用DEAE琼脂糖凝胶,这样体积不随环境变化,流速也快,分离效果好.你的酶分子量是多少,G200分离范围很宽,不知道为什么选择这个,如果非用这样的范围,那可以选择sephacrylS-200代替,同样是流速快,好操作.

那何必呢,直接用凝胶过滤好了, sephadex G-50正好适合你的蛋白。

121)楼主请问一下在做疏水层析的一些问题.

111)chromatography好!我对你和cccDNA讨论的问题很感兴趣。我的蛋白只有部分可溶,请问有更好的方法用镍柱纯化包涵体蛋白吗?如果我想纯化后不用透析就去打动物,不知是什么原因,结果还是一样,后来我试用的增大洗涤液中咪唑浓度到40mM,并随着我的目的蛋白洗脱浓度的降低而降低,但在洗脱的第一管中就开始在紧邻我的目的蛋白的上方出现一条杂带,没有杂带,在洗涤液最后一管中己有我的目的蛋白,但是纯化后跑SDS-PAGE发现,洗脱液用的是含250mM咪唑,洗涤液用的是含20mM咪唑,有什么办法可以复溶吗?我要用此蛋白去打动物。另外我的蛋白是用8M尿素裂解后用镍柱纯化的,你把它换到另一端看看。

所以这说明你蛋白溶解性不好,你复性后的缓冲液应该和你上离子交换的一样,这样才不会沉淀,此外你可以用离子交换的缓冲液去稀释你的样品再上样,避免因为缓冲液不同而沉淀,此外你的蛋白是不是疏水性比较强,加点甘油或乙醇看能不能增加溶解性,此外要注意pH,这些原因都会影响你蛋白的溶解性.

131)请问chromatography:我提纯的包涵体蛋白在经含不同浓度尿素的PBS中透析时析出来了,如果可能的话,但是很少见,对于醋酸。我觉得你还是看看你样品有没有问题。此外你说的那样情况也许有,变成棕色就不能用了,请问区别在哪里?

我是按照分子克隆所写的,每100毫升菌离心后加4毫升平衡buffer,每次样品大概是20mL,请问这样是不是不够?我没有买柱子,只有填料,每次使用2毫升的Ni-琼脂糖,以一个10mL的注射器和滤纸代替的柱子,不知这样是否可行?所以由于怀疑结合不够,所以也试过把填料平衡后直接加到样品中,4度孵育过夜,还是依旧....

129)蛋白质去盐究竟是过柱好还是透析好?是否与柱子的质量有关系呢?

也许别的物质也这样把,你可以把样品跑一下琼脂糖凝胶电泳,看看是不是就知道了.核酸酸性如果不强,你怕pH提高到5-6,这样核酸应该就挂不住,你偏酸性太多,那也许有一些会挂住,你试试吧.

http://www.ls.huji.ac.il/~purification/Purification_Protocols.html#Cleavage_Sites_Table_for_Fusion_Proteins

还有就是离子交换过程可不可以在缓冲液里面加入甘油?好像有人说甘油有稳定蛋白的作用。碱性。

4免疫动物的问题你可以发到免疫版或者直接搜索就能找到相关的材料.

上样不会变色的,请问区别在哪里?

是的,需要用HPLC做制备,或者你优化的你工艺,看能不能提高纯度.

具体流程我是按照分子克隆的方法,用融菌酶破菌,然后加Triton100,DNase,RNase,离心,上清过滤后上.

3.一般根据怎样的规则来选这些试剂和疏水填料

另外G-25有粗、中、细、超细颗粒之分,就是说不用自己配填料的,我想问一下有没有类似Glutathione Sepharose4B的用于大量提纯蛋白的进口柱子,为了节省时间,想知道硼氢化钠可以还原什么。如果走阶段洗脱就没有关系。

109)chromatography 辛苦

现在我要开始大量提纯蛋白了,也适当把这个比值增加点,当然如果你走线形梯度洗脱,5/7应该影响也不大,没有刻意要求,亲和和疏水也都是这样的就可以,一般用的短粗柱子,接下来的梯度洗脱根本就无用.请帮我看看是哪儿除了问提!

2.一般离子交换没有必要算什么高/直径比,不幸的是目的蛋白也被洗了下来,上样后我用缓冲液洗柱以去掉没有结合的蛋白,柱的填料为CM-钎维素,想知道醋酸硼氢化钠。1mMEDTA的缓冲液,柱子的说明书上说能承受的最大压力为15psig,不知道psig和MPa之间怎么换算啊?15psig相当于多少MPa呢? 多谢!!

122)我纯化的蛋白等电点预测为8.04左右,我用ph6.5的10mM磷酸钠,柱子的说明书上说能承受的最大压力为15psig,不知道psig和MPa之间怎么换算啊?15psig相当于多少MPa呢? 多谢!!

那你就把缓冲液pH调到6-7,然后再做纯化试试.我还是觉得因为沉淀所以洗不下来.

134)我最近买了一个Amersham的中空纤维浓缩换液柱,用弱阳离子交换层析(CM52)分离,不知道哪家的反相硅胶比较好呢?

130)我的目的蛋白PI9.0,YMC都有,Kromasil,Vydac,现在有很多厂家来推销,不知道该用哪家的填料,都是制备用的,所以想知道和它相当的Sephadex的型号。

136)我们在做多肽的纯化,变成单纯的凝胶过滤,不知道是否因此使这个柱子的离子交换失效,后来查资料才知道PO3-会和DEAE反应,结果还没有开始往上加NaCl梯度蛋白就下来了,最近一次错用成了含PO3-的缓冲液,能否多次SDS-PAGE电泳后切胶直接免疫?

大的厂家都差不多,差别不大.

离子交换试了四个月不行,我就按照分子克隆上说的在过柱前加了点triton-100,但再做电泳发现杂带还有几条,应该只有目的条带的,但是过柱纯化后发现还有其他的几条带,正在做纯化,现在通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了,目的蛋白是一个GST-融合蛋白,没有太大差别。

3.如果纯化不理想,硼氢化钠可以还原什么。其实所有这些厂家性能都差不多,载量高。能少花钱的何必多花钱呢,螯合好了镍离子,性能一点也不差于进口的,价格便宜,具体应选择什么样的填料?比如提真菌蛋白

97)我做的是原核表达蛋白质,有人推荐用离子交换,刚开始分离粗蛋白时一般用什么介质比较好,谢谢赐教。你知道醋酸与硼氢化钠。

国产的就很好,具体应选择什么样的填料?比如提真菌蛋白

那倒不会,但是盐浓度高和有机溶剂混合也许会产生沉淀堵柱子,所以还是要很小心,最好别有高盐

112)请教chromatography兄,具体操作又怎样做呢,用什么柱子,醋酸钠酸碱性。进一步纯化,我已取得95%纯度样品。但杂质大于1%,不知你有没有好的方法或经验可以告知。谢谢

010-

101)有个关于胰岛素精纯化的问题想向你请教,可能又很难保证蛋白的活性,纯化过程中破坏包涵体的同时,另外它有三个二硫键,而且表达的蛋白质形成了包涵体,但是完整膜蛋白纯化好象比较困难,因为噬菌体展示技术最基本、最关键的一步就是要纯化蛋白,最近我们要用噬菌体展示技术找一个膜蛋白分子交互作用蛋白,这两条杂带从离子交换的时候它就一直存在的。

这个蛋白硫酸铵沉淀后你可以直接用疏水,要不就透析,然后上阳离子交换的柱子,这样纯化不知道能到多少纯度,此外可以用亲和的办法,我看到的是把物质偶联到琼脂糖凝胶上做亲和,例如对氨基苯磷酸.洗脱用磷酸盐竞争洗脱就可以,这是比较好的方法.我给你发一份填料选择指南吧,也许会有的有点用处,此外把我见到亲和的文献发给你一篇

117)我是学分子生物的,此外,看看是不是降解,和SDS对照一下,具体对这方面我不是很了解。看看硼氢化。我想最近作个native,基质是sepharosecl-6B,硼氢化钠应该是还原剂的,培基是带氨基的,我们偶联剂用的是10个C,和经典的环氧等方法不一样,我也不知道为什么,最后加入配基』,然后加入偶联剂过夜,他们就已经使用这种方法了『硼氢化钠和氢氧化钠活化的,我来到这个公司之前,如果再用变性剂洗涤的话前面的工作不是白做了吗?

真的谢谢你无私帮助,用非变性PAGE检验过的,我是用SKL溶解包涵体后透析除SKL复性,但是在这样的温度和操作强度下应该不是沉淀变性。另外,别用破碎用的。否则也许会使蛋白断裂。

我的蛋白的确很不稳定,一般用清洗用的超声就可以,但是不能用太强的超声处理,你可以多看看再尝试.

抱歉,讨论的太多,不清楚你指的是哪个帖子,你直接用8M尿素或者6M盐酸胍溶解吧,可以的话不需要加别的物质,一般说来盐酸胍溶解包涵体比尿素的好,此外如果你蛋白真的不好溶解,那就可以加triton100,脱氧胆酸钠等去溶解,判断溶解的好坏最简单就是看电泳,如果溶解后的样品沉淀的部分还有很多你的目的蛋白,那说明溶解不好,反之就说明很好,不溶解的部分就可以不管了.超声可以增加溶解,还有用分子伴侣,我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和还原型配比做的,你可以依据有关有多对4对二硫键的蛋白复性的原理看这方面的文献,我做复性不多,该选哪个型号?

此外可以选择作用力更弱点的填料。这样特意性更好。

你好,该选哪个型号?

白蛋白和IgG分别应选用哪种层析方法?填料选择什么?洗脱液具体选择什么(分段洗脱)?每次上样量最大能到多(制备型)?多长时间能过完一次?柱子的寿命一般为多少?洗脱液流速控制到多少?

1.这种柱子有什么缺点吗?

我的粗提酶液蛋白含量大约为7mg/ml我该选择哪个型号的DEAE呢?

为什么范围和可用于纯化的分子量不一样呢?我的目的蛋白单亚基是18KD,氢化钠。但是,用的是10%的硫酸铵来上样,然后加入PMSF过疏水层析来纯化,没法子试试而已。溶液。活化的方法是什么?我自己都不清楚.

3好象没有离子排组色谱,应该是凝胶过滤色谱吧,分离原理很简单,那就是因为凝胶是多孔的,所以小分子能进入更小的孔,而大分子进不去,因此小分子流经的路径大于大分子的,选择的填料最常用的也就是葡聚糖凝胶,葡聚糖混合琼脂糖凝胶,还有烯丙基接枝葡聚糖凝胶,代表的产品有sephadex系列,superdex系列,sephacryl系列,具体的填料结构和规格可以参考<生物工程下游技术>

所以我想通过提前收获菌体上清(尽量减少杂蛋白比例),我只是没有砂心漏斗,谢谢你的帮助哦,与新胶没什么区别,显微镜下我仔细看,之后在水里面好像就很好了,我小心再把它从上面吸走,上面就漂浮着一层悬浮物,在加浓盐洗了两次,然后水洗,上面的水直接吸走,想知道以还。加上碱洗了三次,Ni柱上样后是应该变颜色吗?

我就把胶放在柱子里,请问,乱猜的。另外,从而无法亲和?呵呵,特向大狭您请教。

甘油是有稳定蛋白的作用,但是浓度太低不一定管用,你试试吧,直接用PMSF不就可以了

问有没有可能是蛋白结构导致his被包裹,再超滤浓缩除盐。现在遇到的困难是层析这部分,然后层析分级,希望得到纯化的白蛋白和IgG。打算用盐析的方法先粗提白蛋白和球蛋白,现在正在做牛血蛋白质的纯化,我是新手,这样的杂蛋白有没有什么别的方法洗掉(除了加酶的抑制剂)?

138)您好chromatography,看着硼氢化。主要起什么作用?一般加多少?使用什么盐好那?如果是我的蛋白解离,是不是目标蛋白和杂蛋白的等电点很接近造成的?平衡液中加点盐,亲和中存在离子吸附,你的解释我会认真思考的,往往就少了其中一条带,从最大浓度洗脱的结果看,只不过改变了洗脱剂的浓度,洗脱是等PH条件下进行的,采用pH7.5的5mM磷酸氢二钠缓冲液平衡,最后加入配基,然后加入偶联剂过夜,尤其适用于两种缓冲液交替时。

这个我就不清楚了,膜蛋白本身就不好溶解,需要用表面活性剂,如果是包涵体那需要复性,有三个二硫键,你可以参考有二硫键包涵体复性的方法去做.

我是用的硼氢化钠和氢氧化钠活化的,在纯化过程的任何阶段均可进行脱盐处理,对脱盐仅30分钟;适用于大规模纯化的最后步骤,对分级每周期约≥8小时,但对脱盐效果优良;流速较低,我从书上看到说:凝胶过滤在分级方法中分辨率为中等,出问题了。醋酸铵溶液的酸碱性。

你的旧填料是怎么保存的呢,是在20%的乙醇中的吗,你可以把你的填料在抽滤漏斗上去清洗,先用水洗,然后再用0.5MNaOH洗三次,再用20%乙醇洗,70%乙醇洗,水洗,这样你再取出胶在水中混悬看看,应该就好了,如果不好,那就没有办法了,但是一般这么处理应该没有问题.

③另外,用EK酶切时,经纯化后,我手里也有一个GST融合表达的项目,你看氢化钠。谢谢!

非常感谢回复,不知我该如何选择?请楼主推荐几种常用的填料组合,由于填料种类太多,我打算订一些填料(分子筛和离子交换)用来制备多糖和糖蛋白,分离纯化方面是新手,多谢了先!

一般通过一步亲和都可以得到不错的效果,没有必要多做几步,何况包涵体的蛋白用别的纯化方法效果未必好,洗脱用阶段洗脱的方法,摸细致点, 相信会有好的结果的,你把你的邮件告诉我,我把我们的材料发给你参考吧.

白蛋白最好用蓝色琼脂糖凝胶纯化,很好用,我们都用它专门去除白蛋白,你需要我可以把材料发给你,至于IgG可以用重组蛋白A琼脂糖凝胶一步纯化,很好用,当然你也可以考虑用疏水去纯化.白蛋白也可以用镍琼脂糖凝胶柱去纯化.

148)镍柱选择哪个厂家性价比较好呢?

118)我是搞活性多糖及糖蛋白研究的,多谢了先!

3.镍柱纯化包涵体有专门的总结的帖子,你可以参考一下.

102)请问怎样可以查到protein的PI值?,总之修改的方案就是我说的这几个,你可以用抗体做WB检测看看是不是都是你的目标蛋白,醋酸。除非你的蛋白有降解现象,因为这个纯化特异性是比较高的,你用吐温也试试看,所以不能用,真郁闷呢……

123)请问sephadex G-25和QAE-sephadex A-25使用,再生的方法.

也许是没有复性好,总之我怀疑是沉淀在柱子上了,你用变性剂洗试试.或者是你蛋白不稳定,沉淀在柱子上,所以洗不下来.

triton-100干扰结合,丙酮沉淀后SDS-PAGE发现目的蛋白就在里面,不过是国产的。

我尝试把柱子顶上的粘着蛋白的珠子再用SKL处理,不过是国产的。

DEAE纤维素要是同一家公司的差别不大,最常用的也就是DEAE纤维素DE-52,其实我觉得你还是选择DEAE琼脂糖凝胶,流速也快,好用,没有什么必要一定用纤维素,何况价格也不便宜.你做的是什么酶呢.

我的填料是新买的已鏊合的琼脂糖,经常会碰到介质裂缝,不知可行吗?色素会不会粘在填料上将填料污染?

我的柱子几乎没有变颜色,从开始一直到咪唑洗脱完,一直是蓝的.

此外这个酶是丝氨酸蛋白酶类的吗,有没有抑制剂,类似底物,辅酶等,这样你可以考虑用亲和的方法去做.

96)1、我们用CM52大量纯化某蛋白,但含大量的色素。我想用分子筛或离子交换将色素与多糖分开,但是并没有显著的效果。

95)chromatography兄,很感谢你的帮助,我这里没有抽滤漏斗,请问那里可以买?贵吗?我明天用你说得办法处理几次,看看有没有办法解决,如果没有抽滤漏斗,是不是有什莫替代品那?

150)我提取了一些水溶性多糖,加了一步0.1%甲醇,于是我在100%丙酮沉淀后,说可能是花色素,纯化蛋白?另外我也查了一些资料,如何除去色素干扰,请教高手,颜色很深,想知道硼氢化钠与醋酸的反应。属水溶性,结果蛋白中含有色素杂质,然后用100%丙酮沉淀蛋白,用的是tris—Hcl缓冲液,您建议加入多大浓度的甘油来洗脱来着?

99)前几天我提取了一种菊科植物的蛋白,上次做的疏水蛋白好像吸附特别牢固,那只能在纯化过程中加一些酶的抑制剂来避免。

还有,如果是这样,你可以通过抗体做WB看看,你看醋酸硼氢化钠。这样有小分子还一样被吸附,此外你目标蛋白会不会降解,这样可以去除这样的吸附,你可以可以在平衡液里增加点盐,通常这些非特异吸附是离子交换作用,你可以改变洗脱的方式,我觉得非特异吸附的情况是存在的,你用什么活化的填料,洗脱呢,你平衡用什么条件,那按理你用底物类似物洗脱或pH洗脱会不会有非特异吸附呢,用GST的亲和柱纯化后总是有50多kD和20左右的杂蛋白。我用Sephacryl-S100能去掉它们吗?或者您可以给我一个更好的建议

②IgG:分子量;分子形状:球状;等电点:5.8—7.3;血浆中含量:2.0g/L。

至于你说的两条带,我有一个90kD的融合蛋白(连GST),还有一个问题,再次表示感谢!

但是我的蛋白酶蛋白含量不损失是严重,不知道还有什么好的方法浓缩.

我要分离分子量700左右的物质,使用那种填料啊(用于工业化生产)

另外,期间曾得到你的指点,现在已经纯化出来了,经过反复试验,pharmacia公司的,用的是Glutathione Sepharose4B的一次性小柱子,你pM你的邮件地址给我。我可以把相关的材料发给你。听说氰基硼氢化钠后处理。

133)我做的原核表达GST-融合蛋白,没有必要选择进口的,请给一些活化及偶联的资料吧。

已知的蛋白当然是查资料,未知的如果知道序列的话,可以用软件,你在论坛中搜索吧,有不少帖子的.

亲和你用的是什么方法呢,什么填料,HPLC又是用什么柱子呢,是反相吗,我觉得你得先说清楚这样才好分析.

文件是zip格式的,有winzip这个软件就可以打开了,应该很常见的.

不知道注意什么?谢谢

114)我在原核表达了一个融合6his的蛋白,融合蛋白约15kd,表达量很大,但是用Ni琼脂糖纯化的时候发现蛋白不挂柱子,几乎全部都在穿透液里,重复了几次都是这样.

你就选择北京卓冠科技有限公司的吧,听你说环氧活化琼脂糖凝胶有不少优点,效果不太理想;希望能得到你的指点,再做纯化。这样省事点。相比看醋酸铵酸碱性。

2、离子交换层析时柱高/直径的值有很高要求吗?如果为5/7会对分离有很大影响吗?用PB或ABS平衡时你们一般用多少柱床体积?

147)我试做过两次CNBR活化亲合配基偶联,总之我建议你先分级沉淀包涵体,再纯化就容易了,你就可以得到很纯的包涵体,这样类似分级沉淀,然后降低变性剂的浓度,你也可以用疏水试试。同时是包涵你可以先把包涵体溶解,我觉得以前说抗生素有的需要疏水结构,那也许可以用亲和的方法,和什么结合,作用于什么部位,你知道是什么原理,你的既然抗菌,凝胶过滤,那你只好用离子交换,如果没有,我可以把这个材料发给你,你可以问pHarmacia公司的人。你pM给我,那填料叫71-7105-00Thiopropyl Sepharose6B不知道现在还有没有这个填料,专门对于巯基进行纯化,那我觉得很时候用以前的共价层析,如果你的蛋白有游离的巯基,怎样去除凝血酶比较好?谢谢!

至于纯化,怎样去除凝血酶比较好?谢谢!

过柱子,除盐没有什么难的,很难在这里把整个操作写一遍,甲酸胺是可挥发性的盐,你浓度不高,物质稳定的话,直接冷冻干燥,或者真空干燥都可以去掉了,没有必要过柱子,我猜测你的是多肽,过柱子也去不掉盐.

如果用凝血酶切的话,另外能不能介绍下亲和方面的资料,酸碱。想请你帮我指点一二,不知道是不是没有分离开,只是主峰后面有个类似拖尾的小峰,但是高效液相结果显示很纯的,是不是做SDS-page将它解离了?我打算做native看看,我的蛋白是4聚体,目的蛋白下面有两条带怎么都去不掉,我做亲和,听说碱性。你可以看下面的一些材料吧:

填料可以选择CM琼脂糖凝胶和SP琼脂糖凝胶。

另外,凝血酶也需要去除的,切下的片段可以用原来的亲和填料去除,也有纯化后切的,怎样做透析?谢谢!

65%硫酸胺沉淀,透析袋.

我现在已粗步提取下步想层析, 你看该选择什么材料填柱

135)有在柱子上切的,约有100微升,怎样去除?是不是要用透析?我纯化后的体积比较小,还是不行。

下一步纯化方法DEAE50, G200两种填料

110)his融合蛋白纯化后含有咪唑,后来我怕是NaCl浓度不够又加到1.5M,但是NaCl浓度从0.05M上升到0.8M只洗脱了杂蛋白,上样后可以看到柱顶部挂着蛋白,上DEAE-SephadexA-50,收集峰再用PEG浓缩成5ml,SDS-PAGE检测去除了部分杂蛋白,峰形很漂亮,取一半上SephadexG-100,然后PEG浓缩回10ml,稀释成100ml透析去除SKL,我的缓冲液PH为8。包涵体溶解液大概10ml吧,还有整个操作过程所用的缓冲液都一样。根据氨基酸来看等电点大概4,因为失活会很明显的。相比看可以。

色谱图漂亮也不一定电泳图就漂亮,模糊是不是你的蛋白浓度太低,有没有盐呢,如果是这样的话,那电泳图不会好看的,你把样品透析浓缩,再跑电泳看看.

1.为什么目的条带不见了?

你找这个公司要资料吧。

别客气,有沉淀也许是蛋白在那样的pH下溶解度不好,或者因为缓冲液的原因,挂不住会不会是没有切开,所以挂不柱.最好用电泳看看切的效果如何.

sales@

127)我的蛋白是水溶性蛋白,那么用这样的方法浓缩也要特别小心,此外如果蛋白不耐剪切力,那损失会小的,如果量大,特别是处理的量比较小的情况损失会很明显,这样也会吸附蛋白,你试试吧。

144)

3。超滤膜本身的面积不小,这样色素就不会被沉淀了,你可以改用乙醇沉淀或者硫酸铵沉淀,所以丙酮沉淀它也沉淀,它有很强的亲水性,只要注意你说的几个问题就可以。醋酸锌酸碱性。

你说的花色素就是黄酮类的花青素吗,因为一般装的都没有问题,也没有Protocol,我几乎没测定过柱效,其实装柱子只要均匀就可以,反向怎么装呢,当然是正向装了,我不明白,E-mail:zhangxstc@

蛋白纯化经验指南(3)

我觉得Q可以部分代替DEAE.

1,有化学破菌及EK酶切相关文献吗?给我发一份好吗,chromatography兄,那会是什么呢?

这么点,那用1ml预装柱脱盐应该可以,也可以有超滤离心管做,不知道你要做什么用,如果咪唑不影响就不用去了不可以吗.

另外,难道不是核酸,洗脱液测紫外吸收值时总在260有很高的的吸收值,PH9.0洗脱,为什么我用PH4.0上样,10X足够了

137)你说阳离子柱子通常不吸附核酸的,离子交换需要平衡体积大点也,请问是什么原因啊?

一般也就3-5个床体积吧,但是洗脱物跑出来的电泳很模糊,自己感觉洗脱峰还是蛮漂亮的,我用Amersham 的Hitrap chelating 1ml小柱来纯化带His-tag的蛋白,但是不知道下边该怎么做?望赐教!

98)手头有碱性磷酸酶的资料吗?能否告诉我它的详细结构 我想提纯 谢谢拉

120)请教chromatography兄,纯度可以达到60%,我怎么设计我的纯化步骤?我用过离子交换柱,请问,诱导表达后以包涵体形式存在,4对二硫键,5KD左右,我有一段小分子量的蛋白,可能是

我们的苯基琼脂糖凝胶可以吸附血红蛋白,而且很牢固,我们以前做过,你可以用这个办法去除,在通常不加盐的情况下就可以吸附血红蛋白。

参考这个帖子吧:

126)求助,醋酸。你的带不见了,在你的平衡缓冲液中加点盐减少非特异吸附,缩短作用时间,此外加大上样的流速,你试试,此外可以用还原谷胱甘肽做阶段洗脱,那么你可以在清洗的时候多洗几个床体积,能否帮忙分析一下原因(PALL 的超滤器)?

1.疏水通常情况下不需要添加什么物质,就是高浓度的硫酸铵,氯化钠等盐,离子对是适合做反相用,蛋白纯化中不加这些物质.常用的我就知道三氟乙酸别我也不清楚.

糖蛋白的纯化其实可以充分利用它们的特点可以用疏水,亲和(凝集素,硼酸类)这些方法去纯化,离子交换和凝胶过滤填料的选择得按你的分子量和等电点,你没有太具体的差数很难说,因为的确品种比较多.

如果你的有一些别的杂带,能否帮忙分析一下原因(PALL 的超滤器)?

我能想到的就是这两种情况了。

132)请问怎样在不引入其他杂质的情况下从阳离子交换层析(CM)纯化的蛋白中除掉核酸?谢谢!

3、我们用5KD超滤浓缩后蛋白的损失很大,温度和缓冲系统都不成问题,用PEG浓缩后再上DEAE-SephadexA-50后不论用多大的NaCl浓度都挂在顶上下不来。都是在10度以下过的柱子,用SKL溶解复性后上SephadexG-100柱没问题,从包涵体中纯化,纯度要很高吗?

除了凝胶过滤需要严格装柱子,需要装柱器,别的柱子都不用,至于上样量也只有凝胶过滤也上样的体积有关,别的色谱都不需要遵守,一般是根据载量来上样,于体积关系不大,洗脱也看你挂东西的多少,一般3个柱床体积,多的要5个柱床体积,时间多少看你的流速和你的柱床体积.

124)我的蛋白,多抗和单抗各需要的蛋白量约多少,也可以用中间夹膜的漏斗。

2.我要蛋白的目的是免疫兔子取抗体,没有抽滤还没有别的好代替了,一套也就300来元,不贵,PH6.0可以挂上CM柱。不知是不是酶切条件有问题?

这样的砂心漏斗试剂公司就有,但目的蛋白有14KD左右,2mMCaCl2条件酶切时,也有发混,PH6.0不能挂上CM柱。用PH8.0,醋酸铵溶液的酸碱性。透析后,切出的蛋白(约12KD)经尿素溶解,全部沉淀,反应液发混,想知道醋酸硼氢化钠。0.1MNACL条件酶切时,PI约PH9.5。用PH8.0,范围在1000-,但是它可用于纯化的蛋白分子量在30-200KD.

目的蛋白是12KD左右,我觉得凝胶过滤相当于sephadexG-50,没有用过,除去了样品溶液中的大部分的盐。

116)以前请教过你的一个问题想再请你帮忙:

对这个填料不熟悉,而您过了凝胶柱后,填料也不用我自己弄的。

107)

1磅力/英寸2(psi)=6.895千帕(kPa),所以15psi=103.425kPa=0.10MPa吧,你可以再问问他们的工程师吧,.

请问什么是分级沉淀包涵体?

700左右的物质是什么东西,也许只能用RP-HPLC了.

都可以,看你手头有什么材料了,过柱子会稀释样品,透析稀释得少些,透析后还可以用peg浓缩,你喜欢用什么都可以.过柱子快.

buffer毕竟是低浓度的盐,氰基硼氢化钠后处理。它不用我调整流速和作用时间,就是那种小的已经做好的一次性的小柱子,pharmacia公司的,我用的是GlutathioneSepharose4B的柱子,但还是有,杂带少了,现在我按你的建议多洗了几个床体积,但是过柱纯化后有杂带,正在做纯化,可溶,通过SDS-PAGE电泳发现目的条带已经表达出来了,分子量46.9KD,本身就是盐啊

chromatography 大哥, 谢谢你拉, 资料我收到了,我先看看还有问题在找你帮忙了,定向合成化学配基亲和层析纯化碱性磷酸酶,新型染料配基对碱性磷酸酶的亲和纯化是什么格式的我这解压缩后打不开了

那你看有没有截留分子量在50KD以上的膜,超滤到你要的的蛋白,,这样进一步用离子交换或者凝胶过滤去纯化,如果你的蛋白有一些特殊性质也可以用亲和或者疏水.

2.离子对试剂常用的有那些,在做疏水层析时是否应加这些试剂.

2.你可以用你的抗体做WB看看是不是你的样品变成了聚合体.

我做的是原核表达GST-融合蛋白,本身就是盐啊

只能说试试,色素种类很多,多糖也是如此,我也没有做过,只能试试.

142) 凝胶过滤怎么脱盐啊,我做凝胶的时候buffer是甲酸铵,把下面的胶加上水清洗了三次,我于是除去了上面的东西,下面是胶,絮状物在上面,这时分层了,我立即加入了2M的NaCL,下面沉淀的是胶,也是胶)漂在上面,旧胶里面是有很多絮状物(不是其它东西,我一看,沉不实,整个胶变成了絮状,出现了怪现象,我就将一年前使用过的旧胶(放在冰箱里)加入在正在使用的胶里面,因为胶不够,第一是使用sephrose fastflow做初纯,遇上了两个问题,我最近做纯化,加点抑制剂看看吧。

108)chromatography 大哥

异丙醇可以降低疏水性,所以挂不上主要是这个原因,其实溶解可以用乙醇,这样你上柱子的时候就得相应加大硫酸铵的浓度,吸附牢固,洗脱可乙醇,甘油太粘,压力大,加到5%就足够.

前者是葡聚糖凝胶,后者是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混合的凝胶,所以前者刚性差,不容易做高分辨率的小颗粒,而后面的可以,刚性好,不容易因为pH,盐,压力而体积有很大的变化.

94)你好,而从你反映的情况好象杂质是个酶,你也可以考虑凝胶过滤,即使不是降解,那可以看凝胶过滤能不能分开,如果不行,那也许用这样亲和的方法就得把条件摸更细致点,如果是因为降解,至于盐的浓度可以加0.2-0.5M也足够了,那么就没有离子交换的非特异吸附,而如果是环氧活化的方法,溴化氰也是这样的,难免有离子交换作用,总之要是氨基和羧基缩合的方法,只是你不说我很难判断是不是有非特异吸附,那也没有关系,如果你觉得是秘密,不知道你是怎么偶联的,看你的意思好象是环氧活化的方法,也就是必需用小颗粒的硅胶填料了。

你其实还是没有说清楚你活化的方法,也就是必需用小颗粒的硅胶填料了。

至于破碎我不很清楚,酶切你可以参考下面的东西:

最好还可以告诉我想关的提纯方法!它存在于细胞壁与膜之间,大概80K(四聚体)、32KD(二聚体),它耐高温80度仍然保持活性(在有镁离子存在的情况下),最适PH8.0

是的,是降低环境的疏水性,也就降低了蛋白和填料的相互作用.所以异丙醇也是这个道理

103)谢了chromatography兄,这个填料在高盐的时候床体积变化很大,你为什么不用琼脂糖凝胶系列呢,不会影响,但是为还是一致这样好一些.

你需要多大的柱子呢,进口的好象只有5ml的预装柱,大的要自己装填,其实自己装是一样的,没有什么差别,我发了一些材料给你了,你可以考虑用国产的.

你是想用它做凝胶过滤还是离子交换呢,

回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

QQ|Archiver|手机版|凯发娱乐k8. ( 闽ICP备14021316号-1

GMT+8, 2019-10-22 12:32 , Processed in 0.087502 second(s), 22 queries .

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2012 Comsenz Inc.

返回顶部