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硼氢化钠是什么!植物组织RNA提取的难点及对策

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发表于 2018-2-3 14:12:10 | 显示全部楼层 |阅读模式
动物组织RNA提取的难点及对策
从动物组织中提取RNA是举行动物分子生物学方面研究的必要前提。要举行Northern杂交领悟,纯化mRNA以用于体外翻译或竖立cDNA文库,RT-PCR及差示领悟等分子生物学研究,都须要高质量的RNA。所以,从动物组织中提取纯度高、完全性好的RNA是亨通举行上述研究的关键所在。
从文献报道上看,有许多动物就是由于未能有效地分离纯化其组织中的RNA,硼氢化钠还原苯甲醛。而阻塞了其分子生物学方面研究的进展。想知道硼氢化钠还原后淬灭。普通以为在这些动物组织中,或富含酚类化合物,或富含多糖,或含有某些尚无法确定的次级代谢产物,或RNautomotive service engineers的活性较高。你看硼氢化钠淬灭。在完全的细胞内这些精神在空间上与核酸是分离的,但当组织被研磨,细胞粉碎后,这些精神就会与RNA互相作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地连结,招致RNA活性丧失及在用苯酚、氯仿抽提时RNA的损失[1],或造成不溶性复合物[2];而多糖会造成难溶的胶状物,与RNA共沉淀上去[3];萜类化合物和RNautomotive service engineers会分散造成RNA的化学降解[2]和酶解。对付这些动物资料,用常例的RNA提取方法(如胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等)难以提取出其RNA。如Lбpez-Gбmez等在用常例的方法提取芒果果实的RNA时未能告捷,其实硼氢化。他们的完结分为三种境况:提出的RNA已被降解;RNA的得率很低;取得的RNA不能举行体外翻译。他们以为在果实幼稚时各种酶的活性增强,其中也包括RNautomotive service engineers,不溶性的淀粉转化为可溶性的多糖,芒果果实细胞壁中额外的成份,以及果实中高含量的多酚化合物都是骚扰RNA提取的身分[4]。Tesniere等在用苯酚法和胍法提取葡萄果实的RNA时,发明RNA与某种未知化合物凝固成不溶性的复合物,并且这种未知化合物在230nm和270nm处有强的光罗致,你看硼氢化钠的还原。从而骚扰了RNA紫外罗致的测定[5]。所以能否有效地去除多糖、酚类化合物、RNautomotive service engineers和骚扰RNA提取的其它代谢产物是提取高质量动物RNA成败的关键。本文依照文献综述了解决上述动物RNA提取经过中难点的相应对策。
1酚类化合物的骚扰及对策
许多动物组织特别是动物的果实(如苹果、樱桃、李子、葡萄等)[6]和树木类动物中[1]富含酚类化合物。酚类精神的含量会随着动物的生长而补充。因而从幼嫩的动物资料中更简略单纯提取RNA。此外,针叶类动物的针叶中多酚的含量比在落叶动物的叶子中要高得多[1]。我不知道组织。在动物资料匀浆时,酚类精神会开释进去,氧化后使匀浆液变为褐色,并随氧化水平的补充而加深,这一情景被称为褐化效应(lightly whiteingeffect)[7]。被氧化的酚类化合物(如醌类)能与RNA牢固地连结,从而影响RNA的分离纯化。对于难点。但Newconceing等发明RNA提取的难易水平与资料中酚类精神的总量之间并无相关性,所以以为不是全数的酚类化合物都影响RNA的提取。但普通以为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类精神(如原花样素类精神)是影响RNA提取的一类化合物[8]。目前去除酚类化合物的普通途径是在提取的初始阶段避免其被氧化,然后再将其与RNA隔离。
1.1避免酚类化合物被氧化的方法
复原剂法:普通在提取缓冲液中参与(-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或半胱氨酸[9]来避免酚类精神被氧化,有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2%[10]。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等以为在过夜沉淀RNA时参与(-巯基乙醇(终浓度1%)可以避免在此经过中酚类化合物的氧化。硼氢化钠(NaBH4)是一种可复原醌的复原剂,rna。用它治理后提取缓冲液的褐色可被消减,醌类化合物可被复原成多酚化合物[7]。
螯合剂法:螯合剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)中的CO-N=基有很强的连结多酚化合物的能力,其连结能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的补充而增强。原花样素类精神中含有许多芳环上的羟基,因而可以与PVP或不溶性的PVPP造成牢固的复合物,使原花样素类精神不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化,并可以在自此的抽提次序中被除去[6]。用PVP去除多酚时pH值是一个紧要的影响身分,在pH8.0以上时PVP连结多酚的能力会快捷下降[11]。当原花样素类精神量较大时,硼氢化钠标准溶液配制。孑立使用PVPP无法去除全数的这类化合物,因而须要与其它方法连结使用[6]。
Tris-硼酸法:若是提取缓冲液中含有Tris-硼酸(pH7.5),其中的硼酸可以与酚类化合物仰仗氢键造成复合物,从而压榨了酚类精神的氧化及其与RNA的连结。这一方法至极有效,所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再参与其它复原剂[4]。但若是Tris-硼酸浓渡过高(>0.2M)则会影响RNA的回收率[7]。
牛血洁净蛋白(BSA)法:原花样素类精神与BSA间可发生近似于抗原-抗体间的互相作用,植物组织RNA提取的难点及对策。造成可溶性的或不溶性的复合物,减小了原花样素类精神与RNA连结的机缘,学会硼氢化钠能还原那些。所以进步了RNA的产量。BSA与PVPP连结使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNautomotive service engineers,因而在使用时要参与肝素以压榨RNautomotive service engineers的活性[6]。
丙酮法:Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的动物资料,可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的动物资料中分离到高质量的RNA[1]。
Guillemould like等[12]和Ainsworth[13]以为低pH值(pH5.5)的提取缓冲液可以避免酚类化合物的离子化和进一步的氧化。
1.2酚类化合物的去除
经过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA连结的多酚,可以间接经过离心去除掉,或在苯酚、氯仿抽提时除去[6]。你知道硼氢化钠水溶液稳定吗。Ma wonderfulning哄骗高浓度的2-丁氧乙醇(50%)来沉淀RNA,而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。学习硼氢化钠淬灭。然后用含50%2-丁氧乙醇的缓冲液洗刷RNA沉淀以去除残留的多酚。他以为假使多酚被氧化,其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除,无需再用NaBH4来治理[14]。
2多糖的骚扰及对策
多糖的净化是提取动物RNA时常遇到的另一个顺手的题目。动物组织中往往富含多糖,而多糖的许多理化性子与RNA很相似,所以很难将它们隔离。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了,造成RNA产量的省略;而在沉淀RNA时,也发生多糖的凝胶状沉淀,这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水,氢化钠。或溶解后发生浓厚状的溶液。由于多糖可以压榨许多酶的活性[15],所以净化了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常例的方法中,经过SDS-盐酸胍治理可以部门去除一些多糖;在高浓度Na+或K+离子保存条件下,经过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖;经过LiCl沉淀RNA也可以将部门多糖留在上清液中[7]。但假使经过这些次序仍会发明有相当多的多糖与RNA混杂在一起[13],所以还须要用更有效的方法来解决动物RNA分离纯化时多糖净化的题目。
用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中迟钝参与无水乙醇至终浓度10%~30%,硼氢化钠标准溶液配制。可以使多糖沉淀上去,而RNA仍保存于溶液中。普通都是在动物资料的匀浆液中参与乙醇,如Lewinsohn等在从裸子动物的木质茎中提取RNA时,在匀浆上清液中参与乙醇至终浓度10%以沉淀多糖[3]。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时,是在用CsCl超离心,乙醇沉淀之后的RNA溶液中参与终浓度30%乙醇来沉淀多糖的,进一步纯化了RNA样品[5]。
另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bohloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中参与1/3体积的5M醋酸钾(pH4.8)溶液以沉淀多糖[9];Ainsworth在提取酸模动物花组织的RNA时参与的是1/5体积的5M醋酸钾(pH4.8)溶液[13]。是什么。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾(pH6.5)溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质[16]。在提取某些动物资料的RNA时,是将上述两种方法连结使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时,是在匀浆液中参与0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质[4]。Su等在去除褐的多糖时,孑立使用乙醇或醋酸钾都有效,唯有两者连结使用效果最佳[7]。
Fa wonderfulg等以为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖[15]。Cha wonderfulg等在提取松树RNA时,缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M,学会硼氢化钠是什么。经过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离[10]。Ma wonderfulning是将胡萝卜种子等资料苯酚提取后的上清液浓缩,调剂Na+离子浓度至80mM,然后参与0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖[14]。
3蛋白杂质的影响及对策
蛋白质是净化RNA样品的又一个紧要身分。由于RNautomotive service engineers和多酚氧化酶亦属于蛋白质,硼氢化钠能还原那些。因而要获得完全的、高质量的RNA就必需有效地去除蛋白杂质。常例的方法是在冷冻的条件下研磨动物资料以压榨RNautomotive service engineers等的活性;提取缓冲液中含有蛋白量变性剂,如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等,这样在匀浆时可以使蛋白量变性,对策。凝固;有的方法是哄骗蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。
Wilcockson哄骗蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70%高氯酸钠溶液中,RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度,因而将大部门蛋白质沉淀上去。接着在离心上清液中参与两倍体积的无水乙醇,这时RNA能沉淀上去而能溶于70%高氯酸钠溶液中的残留蛋白质如故留在上清液中。对于硼氢化钠是什么。这样可以除去绝大部门的蛋白质[17]。
4次级代谢产物的影响及对策
从动物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多初等动物组织特别是幼稚组织能发生某些水溶性的次级代谢产物,这些次级代谢产物很简略单纯与RNA结归并与RNA联合被抽提进去而阻塞具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物完全是什么精神,所以,学习硼氢化钠三氯化铝还原。目前还没有什么额外的方法来解决这个题目。Baker等[18]分析Hughes等[16]的选拔性沉淀法、Chirgwin[19]的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、幼稚松树针叶等动物组织的RNA。
由于动物组织特别是初等动物组织细胞内外组成成分的庞杂多样性,使得动物组织RNA的提取绝对付其它生物资料来说要贫困的多。实验中时时会发明,假使同一种动物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同;含有某种骚扰身分的不同动物资料,其适用的RNA提取方法或者不同;假使是同一种动物同一种组织资料,但源泉于不同基因型植株,听说提取。其RNA提取方法也或者不一样。所以,对付某一动物或其组织来说,其相应的RNA提取方法必需经过搜求和实验才智确立。
随着动物分子生物学研究规模的拓宽,可以必定地说,在作为其研究根柢的动物资料RNA提取经过中还会出现新的难点,但随着连接地探索和阅历的积聚,迷信事务者们一定会快捷地解决这些难点,对于硼氢化钠能还原那些。为动物分子生物学的发扬铺平门路。
你知道植物
硼氢化钠是什么
植物组织RNA提取的难点及对策
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